《氧化应激状态下维持黑素小体蛋白低免疫原性 的分子机制研究》：研究背景及目的： 黑素为一组单体吲哚分子（DHI－优黑素和DHI（ ：A．优黑素），通 过共价键连接，并与醌和蛋白质高度聚合而形成的一 种异质性聚合 物（heterogeneouscopolymers）。这两种吲哚分子 能以不同比例相互 交联（cmss—linked），在共聚合过程中形成π－堆 叠（π－staeked）层状 的大分子网络系统。在黑素生成过程中，多个黑素生 成蛋白参与对 黑素生成代谢的调控，共同影响着黑素生成的质与量 。其中，Tyr 可催化L－酪氨酸羟化生成L－多巴和L一多巴氧化生 成L－多巴醌，为 黑素生成的限速酶。另一个重要的调节靶点是Dct催 化多巴色素异 构重排生成5，6一二羟基吲哚羧酸（DHIC1A），然而 DHICA自身并 不能发生聚合，只有在DHI’和Tyr存在时，DHICA才 被掺人到黑 素聚合物中，否则多巴色素快速自发脱羧生成5，6一 二羟基吲哚 （DHI）和大量ROs。已有研究证实，三种黑素生成蛋 白（Tyr、 Tyrpl和Dct）在黑素小体内组成一多酶复合体结构， 目的是提高黑 素生化合成效率，维持酶蛋白自身的稳定和最大限度 减少中间产物 的细胞毒性。
在多酶复合体中，Det被认为是一种原位实时氧 化应激清除剂 （reahimescavenger），它能瞬时清除中间产物所诱 生的活性氧基， 通过调节DHI／DHICA比例，动态影响着黑素生成和吲 哚分子的生 物聚合速率，从而调整黑素细胞对uVR的防护能力， 最终使皮肤 黑素生成增加。此外在黑素生化反应过程中，黑素小 体内部近似于 封闭的结构被认为是黑素细胞最大程度地减少黑素前 体物质细胞毒 性的一种防护策略。黑素小体蛋白极有可能被包被于 黑素小体的各 个球形实体的内核中，形成“盾样”屏障结构，以保 护蛋白免遭氧 化攻击。与此同时，黑素细胞还拥有强大的酶和非酶 抗氧化防护机 制（如谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、Fenton反 应等），以瞬 时清除中间产物诱生的活性氧基，使黑素细胞和黑素 小体蛋白免遭 损伤。然而，对黑素小体蛋白与黑素聚合物之间的相 互作用及其在 高和或持续的氧化应激状态下，是如何免遭氧化应激 损伤，以维持 其低免疫原性的机制仍知之甚少。
体内外研究已证实过氧化氢（H202）在白癜风患 者表皮内大量 堆积，甚至高达毫摩尔浓度。且在白癜风患者进展期 皮损和／或血 清中，已检测到的多种抗黑素小体蛋白的自身抗体和 T淋巴细胞 表达异常。功能性的黑素细胞障碍或缺失被认为是黑 素小体蛋白自 身反应T细胞或自身抗体介导的一种免疫反应。然而 ，白癜风黑 素细胞Dct基因的功能调节失调和分子损伤机制是如 何发生的，免 疫系统是如何识别这些黑素小体内膜上隐蔽的抗原表 位肽，黑素小 体蛋白免疫耐受的状态又是如何遭到破坏的，至今仍 未清楚。新近 研究发现，在一定浓度H2O2作用下，甲状腺球蛋白可 发生断裂， 生成具有免疫反应性的多肽，这些多肽还能被桥本氏 甲状腺炎病人 血清中抗甲状腺球蛋白自身抗体所识别。因此我们推 测，激发对黑 素细胞的免疫破坏的始动因素可能为：（1）白癜风 黑素细胞很可能 在清除黑素生成中间产物及活性氧基方面存在一定缺 陷，大量生成 的活性氧基分子（尤其是H202）可对已发生聚合的黑 素进行高强度 的攻击，导致黑素聚合物中吲哚单位发生氧化断裂， 使内部隐蔽的 抗原表位肽暴露；（2）与吲哚单位相连的黑素小体 蛋白发生断裂， 生成具有免疫反应性的多肽如未能即使清除，则氧化 修饰后的蛋白 片段可能成为半抗原，具有强的免疫原性；（3）多 巴色素异构酶 （Dct）灭活使DHJCA／DHI吲哚单位遭到破坏，丧失 其抗氧化能力， 甚至可能会表现为促氧化作用。
体内直接研究Dot调控的氧化应激改变对黑素小 体蛋白免疫原 性影响的早期上游事件十分困难，部分原因是由于 Dct在黑素小体 内与其他黑素生成蛋白密切结合形成多酶复合物结构 。因此在本研 究中，我们应用蔗糖梯度离心法从Dct突变slatyrMC （第194位精氨 酸被谷氨酰胺置换，R194Q）和野生型melan－aMc分 离不同时期的 黑素小体蛋白，并将这些蛋白免疫小鼠的后脚垫，体 内测定这两种 黑素细胞衍生的黑素小体蛋白的免疫原性以及不同氧 化应激状态对 其免疫原性的影响，以期揭示白癜风黑素细胞黑素小 体膜上的这些 自身蛋白抗原免疫耐受状态破坏的分子机制和激发抗 黑素细胞自身 免疫反应的始动事件。
刘小明专著的《氧化应激状态下维持黑素小体蛋 白低免疫原性的分子机制研究》：研究方法与结果： 1）．Dct突变slatyMc和野生型n5elanIaMc内黑 素生成相关蛋白 酶活性及ROS水平测定：分光光度计法测定Dct突变 slatyMC和 野生型melan－aMC内Tyr（主要是多巴氧化酶）、Dct 和过氧化氢酶 活力。二氯荧光素（H2DCF－DA）标记法测定两种MC 在经100 μmol／LH2O2处理前后胞内ROs水平的变化。结果显 示；与melan． aMc相比，slatyMcDct酶活力明显减低，而Tyr、过氧 化氢酶活 性在两组MC之间差异无统计学意义（P＞O．05）。细 胞内ROS水平 测定结果显示，H202处理前，slatyMC和melan－aMC 胞内的ROS 相对荧光强度分别为6．33±0．17和5．42±O．14， 但处理后，slaty Mc胞内的ROS相对荧光强度（18．29±0．34）急剧增 加，与mehin．a MC（9．14±0．28）相比，差异具有统计学意义（P ＜O．05）。
2）蔗糖梯度离心分离Dct突变slatyMC和野生型 melan—aMc 黑素小体超微结构及其蛋白表达水平测定：将Dct突 变slatyMc和 野生型melan—aMc分别用0．25％胰酶／0．02％EDTA 消化，收获细 胞后将细胞团块匀浆，蔗糖梯度离心分离黑素小体。
蔗糖浓度梯度 分别为1．0、1．2、1．4、1．5、16、1．8和2． 0moL／L．取1．0～ 1．2moL／L和1．6—1．8mol／L梯度界面行透射电子 显微镜（TEM）观 察黑素小体发育与成熟。分光光度计法和 WesternBlot蛋白印迹技 术测定蔗糖梯度离心片段三种酪氨酸酶家族蛋白酶活 性和蛋白表达 水平。结果发现，两种MC匀浆团块颜色分别为棕褐色 和奶黄色。
蔗糖梯度离心后，可见离心条带分别位于1．0、1．2 、1．4、1．6、1．8 和2．0moL／L蔗糖界面上层。透射电子显微镜观察发 现，1．2～ 1．4mol／L层蔗糖片段主要富含呈球形或卵圆形的I ．II期黑素小体 （早期黑素小体），1．6～l8mol，／L层蔗糖片段主 要富含以黑素沉积 在纤维状横嵴上为主的III—IV期黑素小体（晚期黑 素小体），与离心 分离的melan—aMc1．6～1．8mol／L层蔗糖片段相比 ，slatyMC 1．6～1．8moJ／L层蔗糖片段则主要为III期黑素小 体。westernB10t 蛋白印迹结果显示，sIatyMc晚期，黑素小体蛋白Dct 活性明显减 低，与melm－aMc晚期黑素小体蛋白相比，差异具有 统计学意义 （P＜O．05），而酪氨酸酶活性则在两组黑素小体蛋 白之间变化不明 显。
3）实验小鼠分组及免疫：将cB6F1（BAB［／c× C57B［／6杂交 Fl代，HLAl单倍型为H2d*2b）小鼠分笼饲养，分别给 予3种因素 处理黑素小体蛋白后免疫小鼠，比较其免疫原性的改 变：（1）将两 种Mc分别用100μmoL／LH202处理1h，蔗糖梯度离心 分离早期和 晚期黑素小体蛋白，测定黑素在维持黑素小体蛋白低 免疫原性中所 发挥的作用；（2）将合成的DHI－优黑素和DItICA－ 优黑素分别与蔗 糖梯度离心分离的两种Mc晚期黑素小体蛋白进行孵育 ，经H，0， 处理后来测定其抗氧化保护能力；（3）将蔗糖梯度 离心分离的两种 Mc晚期黑素小体蛋白分别经H202处理，验证是否为 Dct突变slaty MC晚期黑素小体蛋白对氧化应激更为敏感。另以OvA 作为阳性 对照。结果发现，黑素小体蛋白（50μg）与等体积 的弗氏完全佐剂 （CFA）乳化皮下注射小鼠脚垫与鼠尾根部一周后， 肉眼可见小鼠免 疫侧后肢沿脚垫向上逐渐肿胀。3周后，动物处死分 离区域引流淋 巴结时也发现，小鼠腹股沟、胁肋引流淋巴结及脾脏 明显肿大。
4）氧化应激及合成的DHI／DHICA（1：1），优 黑素对黑素小体蛋 白免疫原性的影响：将T淋巴细胞分离后盼蓝染色计 数，接种相 同数目韵T淋巴细胞至96孔板（1×105／孔），加入 终浓度分别为 O．3、1、3、10、30μg／mL的同等黑素小体蛋白， 于37°c、5％C0， 共同孵育2天。每孔加入1uci。H－TdR继续培养i4～ 16h，多头样 品细胞收集器收集细胞，用3H－TdR掺人法测定黑素 小体蛋白对T 细胞的回忆增殖反应。用相同黑素小体蛋白包被酶标 板，ELISA法 测定抗黑素小体蛋白抗体的终点稀释滴度。显微镜下 观察发现，自 H2C）z处理的slat）rMc分离获得的晚期黑素小体蛋 白较早期黑素小 体蛋白T淋巴细胞克隆体积增大，胞浆增多而深染， 多呈圆形或 椭圆形；与DHI／DHICA（1：1）－优黑素孵育的 slatyMC晚期黑素小 体蛋白较DHI－优黑素孵育组T淋巴细胞克隆数目明显 减少，单个 克隆体积变小；而与melan—aMC晚期黑素小体蛋白相 比，slatyMC 晚期黑素小体蛋白经H2O2处理后较同等蛋白对照组T 淋巴细胞克 隆数目增多，单个克隆体积增大O33H—TdR掺入法和 ELISA法测定结 果也显示，晚期黑素小体蛋白尤其是slatyMC晚期黑 素小体蛋白表 现为明显的免疫原性增强；与DHI．优黑素孵育的晚 期黑素小体蛋 白可明显诱导T细胞增殖反应增强和特异性抗晚期黑 素小体蛋白 血清lgG滴度增高；而且与melan—aMC相比，从 slatyMc分离的 晚期黑素小体蛋白对氧化应激更为敏感，表现为T淋 巴细胞回忆 增殖反应增强和特异性抗晚期黑素小体蛋白血清IgG 滴度增高。
研究结论： Dct通过促进一定比例的DHICA单体掺人到DHI聚 合骨架中， 影响着黑素的抗氧化能力，从而在维持黑素小体蛋白 低免疫原性中 发挥着重要的作用。而Dct突变则严重影响晚期黑素 小体的发育成 熟，同时致DHICA一优黑素合成减少，ROS清除能力减 低，尤其是 细胞在氧化应激状态下更为明显。slaty突变（Dct基 因编码区第194 位精氨酸被谷氨酰胺置换（R194Q））严重影响Dct蛋 白立体结构和 黑素生成蛋白复合体的稳定性，在持续或高氧化应激 状态下，黑素 小体蛋白可发生氧化修饰，使部分的隐蔽抗原表位暴 露，增强黑素 小体蛋白免疫原件。
引言
第一章 Dct突变对黑素小体蛋白表达及其相关生物学功能的影响
1．1 实验材料
1．1．1 细胞来源
1．1．2 主要仪器设备
1．1．3 主要试剂及其配制
1．2 实验方法
1．2．1 细胞培养
1．2．2 胞内ROS水平测定
1．2．3 过氧化氢酶酶活力测定
1．2．4 不连续蔗糖梯度离心[23]
1．2．5 蔗糖梯度离心片段酪氨酸酶活性测定
1．2．6 蔗糖梯度离心片段Dct活性测定[25-26]
1．2．7 蔗糖梯度离心片段电镜检查[18]
1．2．8 western蛋白印迹检测蔗糖梯度离|心片段
引言
第一章 Dct突变对黑素小体蛋白表达及其相关生物学功能的影响
1．1 实验材料
1．1．1 细胞来源
1．1．2 主要仪器设备
1．1．3 主要试剂及其配制
1．2 实验方法
1．2．1 细胞培养
1．2．2 胞内ROS水平测定
1．2．3 过氧化氢酶酶活力测定
1．2．4 不连续蔗糖梯度离心[23]
1．2．5 蔗糖梯度离心片段酪氨酸酶活性测定
1．2．6 蔗糖梯度离心片段Dct活性测定[25-26]
1．2．7 蔗糖梯度离心片段电镜检查[18]
1．2．8 western蛋白印迹检测蔗糖梯度离|心片段
Tyr、Tyrpl、Dct蛋白表达[27]
1．3 统计学处理与结果
1．3．1 slaty．与melan-a黑素细胞Tyr、Dct和过氧化氢酶活力比较
1．3．2 slay MC与melan-a MC过氧化氢处理前后 胞内ROS水平比较
1．3．3 slaty MC与melan-a MC蔗糖梯度离心片段超微结构观察
1．3．4 slaty MC与melan-a Mc早期和晚期黑素生成蛋白表达水平及酶活性比较
1．4 讨论
第二章 Dct调控的氧化应激改变对黑素小体蛋白免疫原性的影响
2．1 实验材料
2．1．1 CB6F11小鼠来源
2．1．2 主要仪器设备
2．1．3 主要试剂及其配制
2．2 实验方法
2．2．1 CB6F1(H2d*2b)小鼠免疫
2．2．2 CB6F1(H2d*2b)小鼠T淋巴细胞分离及培养
2．2．3 CB6F1(H2d*2b)小鼠眼眶静脉丛血样采集
2．2．4 黑素小体蛋白诱导的体液免疫反应测定
2．2．5 黑素小体蛋白诱导的细胞免疫反应测定
2．3 统计学处理与结果
2．3．1 黑素小体蛋白免疫cB6Fl小鼠后解剖学观察
2．3．2 黑素小体蛋白免疫CB6F1小鼠后T淋巴细胞形态学观察
2．3．3 slay MC和melan-a MC早期与晚期黑素小体蛋白免疫原性的比较
2．3．4 氧化应激对黑素小体蛋白免疫原性的影响
2．4 讨论
第三章 合成的DHI／DHICA(1：1)一优黑素在维持黑素小体蛋白低免疫原性中的作用
3．1 实验材料
3．1．1 CB6F1小鼠来源
3．1．2 主要仪器设备
3．1．3 主要试剂及其配制
3．2 实验方法
3．2．1 CB6F1(H2d*2b)小鼠免疫
3．2．2 CB6F1(H2d*2b)小鼠T淋巴细胞分离及培养
3．2．3 CB6F1(H2d*2b)小鼠眼眶静脉丛血样采集
3．2．4 黑素小体蛋白诱导的体液免疫反应测定
3．2．5 黑素小体蛋白诱导的细胞免疫反应测定
3．3 统计学处
刘小明，男。2011年毕业于武汉大学第一临床学院内科学专业．获博士学位。现在常州市第一人民医院工作。主要研究方向为皮肤黑素细胞生物学与皮肤光老化。博士学位论文指导老师：雷铁池。
